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核酸检测如何更快?
发布时间:2022-08-11 16:06:20 来源:yabo官网登录网址 作者:yobo体育APP官方版
  诊断追求快是一种本能。新冠疫情下大热的核酸检测为什么就做不快呢?笔者在深圳,每次采完鼻咽拭子之后,一般至少需要半天时间才能得到核酸检测的结果。当然这里面最大的问题还是在于当前的核酸检测依赖于专业的实验室和专业的操作人员,所以有一个样本周转的时间,即将样本由采样点送到有检测条件的地方集中检测所花费的时间。  核酸检测包括两大步骤:核酸提取和核酸扩增。核酸提取需要的时间一般远小于核酸扩增的时间。有的核酸提取仪能够在10分钟左右做完一个核酸提取。但是对于核酸扩增,当前所需时间普遍还是在1个小时以上。所以这个问题变成了如何把核酸扩增做快。而当前,为了保证核酸检测的准确性,核酸扩增普遍采用PCR技术。所以如何把核酸检测做快的问题又进一步变成了如何把PCR做得更快。这就是今天我们要聊的话题。  首先,对PCR技术进行一...
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产品介绍

  诊断追求快是一种本能。新冠疫情下大热的核酸检测为什么就做不快呢?笔者在深圳,每次采完鼻咽拭子之后,一般至少需要半天时间才能得到核酸检测的结果。当然这里面最大的问题还是在于当前的核酸检测依赖于专业的实验室和专业的操作人员,所以有一个样本周转的时间,即将样本由采样点送到有检测条件的地方集中检测所花费的时间。

  核酸检测包括两大步骤:核酸提取和核酸扩增。核酸提取需要的时间一般远小于核酸扩增的时间。有的核酸提取仪能够在10分钟左右做完一个核酸提取。但是对于核酸扩增,当前所需时间普遍还是在1个小时以上。所以这个问题变成了如何把核酸扩增做快。而当前,为了保证核酸检测的准确性,核酸扩增普遍采用PCR技术。所以如何把核酸检测做快的问题又进一步变成了如何把PCR做得更快。这就是今天我们要聊的话题。

  首先,对PCR技术进行一个科普。聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR基本反应步骤分为三步:1、变性:反应温度在95℃维持15-30s左右,高温会使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。2、退火(复性):反应温度从95℃降温至60℃,在该温度下维持15-30s,引物与模板按照碱基互补配对原则进行结合。3、延伸:将反应温度调节至酶的最适温度(72℃),在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下,形成与模板链互补的新的DNA链。

  对于阳性样本,反应试剂每经过这三个步骤(我们也叫一个PCR温度循环),靶DNA片段的量就翻上一番。PCR通常做30-45个循环。所以,你看看,整个PCR反应的速度很大程度上决定于单个PCR温度循环的时间。下文从四个角度来论述,如何将PCR做得更快。

  压缩PCR反应中变性、退火、延伸对应的时间是最有效的压缩PCR反应时间的方式。比如,一个典型的PCR反应循环中,需要变性95℃ 20s,退火60℃ 30s,延伸72℃ 10s。那么忽略反应试剂本身升降温所需时间,一个PCR反应循环也要1min。40个循环便是40min。如果通过优化引物探针设计,优化反应体系,选用更为合适的酶等手段将反应时序变为变性95℃ 10s,退火和延伸一起60℃ 20s,那么一个PCR反应循环就只需要0.5min。忽略反应试剂本身升降温所需时间,40个PCR反应循环便只需要20min。与上一个检测时序相比,新的检测时序就快了20min。

  这里面最典型的就是GeneXpert及其前身SmartCycler。赛沛先开发出的SmartCycler只是用作快速QPCR反应的反应管。后面又在此基础上设计出了GeneXpert——带有核酸提取和QPCR扩增功能的全自动核酸检测系统。

  无论是SmartCycler还是GeneXpert,其PCR反应区域都是典型的“large surface temperature area with thin wall enclosure”结构。接触面积大而且壁很薄(一层PP薄膜)。所以,GeneXpert和SmartCycler能够实现快速的PCR逻辑也很清晰:我们的PCR反应管接触面积很大(导热面积大),反应管的壁超级薄(导热效率高),所以热量由加热模块传递到反应液体时候,传递的速率也非常快。所以在新冠核酸检测中GeneXpert可在30分钟左右实现样本进结果出的核酸检测。

  Space Domain:该控温方式下,有固定的两个或三个温度区域,比如95℃和60℃,液体在两个或三个温度区域内来回流动以实现数十个PCR的温度循环。简单来说,就是以空间上的温度循环来取代传统QPCR仪上的时间上的温度循环(time domain)。这种实现方案直接省去了传统QPCR仪上的time domain方案中的热量由金属底座经PCR反应管管壁传递给最终的液体反应试剂环节。热量直接由周围加热器传递给了最终的反应液体。因此这种方案热传导效率得到了大幅度提升。

  这里典型的有两个产品,罗氏旗下的Cobas Liat及GenMark ePlex system(罗氏2014年4月宣布以4.5亿美元收购微流控分子诊断产品cobas Liat的母公司Iquum;罗氏(Roche)与GenMark Diagnostics 2021年3月15日共同宣布,双方已就总交易价值约18亿美元现金收购后者事宜达成最终并购协议)。

  Cobas liat是在master mix 1和master mix 2两处囊袋形成两个固定的温区。在PCR反应中,PCR反应试剂被挤压以在两个固定温区来回移动,以实现了PCR反应温度循环。因此,Cobas liat在上呼吸道感染检测中可以在20分钟内实现样本进结果出。

  包含三个铜加热器的蛇形微流控 PCR 装置:反应试剂从入口处流入后,不断的流过变性95℃温区,延伸72℃温区,退火55℃温区,从而实现了30个PCR反应的温度循环。

  2. 通过EWOD(电浸润法)控制PCR反应液滴在不同的温度场之间来回移动,从而实现了PCR反应对应的温度循环。

  GenMark ePlex system就是采用的类似的方案(EWOD控制PCR反应液滴在不同温区之间来回移动),具体视频如下:

  由于PCR反应过程是一个高度温度敏感的过程,我们需要做到在实际反应过程中,液体温度能及时准确的达到我们预设的PCR温度循环里的温度值。在实际的温度控制过程中,一般温度传感器是测量PCR反应腔室周围的温度。虽然PCR反应腔室周围的温度也能大致反映出PCR反应液体的温度,但是在实际应用过程中由于存在温度场的分布以及热传导时间问题,PCR反应腔室周围的温度往往与PCR反应液体的温度存在一定的差异。这种差异主要体现在两个方面,一是在温度达到稳定的时候,PCR反应液体的温度和传感器温度的固有差值∇T;另外一个是,当发生温度变化后,液体温度稳定相对于传感器温度稳定的时间滞后∇t。前者直接关系到我们以温度传感器感知温度作为基准的时候的控温目标(比如液体控温目标是60℃,考虑到∇T的存在,温度传感器的控温目标可能定为61℃),后者则直接制约着温度控制的速度。

  所以,想做到反应液体温度快速达到预设的变性/退火/延伸温度,就要允许加热模块的温度有适当超调,但是最终液体温度又能平稳落在预设的温度范围内。这就需要好的温控算法。我们可以看看GeneXpert的温控曲线:

  预设变性温度为S2,预设的退火/延伸温度为S1。203曲线就代表的是一个PCR温控循环里加热的金属模块的温度变化情况,204曲线代表着一个PCR温控循环里反应液体实际的温度变化情况。我们可以看到,为了使反应液体试剂的温度尽快达到预设的S2,要允许加热模块有温度超调(203曲线时间段温度高于预设的变性温度S2)。同样的,在降温阶段加热模块的温度也有适度超调(203曲线的后半段,温度低于预设的退火/延伸温度S1)。这样使得PCR反应液体温度平稳、快速地到达预设的温度,从而缩短了整个核酸检测的时间。

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